Birusak eta minbizi-zelulak, antigorputzak bilatzeko ezusteko lagunak

Infekzioetarako, minbizirako, gaixotasun autoimmuneetarako… Antigorputzetan oinarritutako terapiek gorantz egin dute azken urteotan. Baina nola topatzen dira ospitaleetan erabiliko diren antigorputzak? Arraroa izan daitekeen arren, erantzunak zerikusia du minbizi-zelulekin eta birusekin.

Zer eta nolakoak dira antigorputzak?

Gure gorputzeko defentsen ardatzetako bat dira antigorputzak; arrotza dena ezagutzen dute, eta immunitate-sistemak ezabatzeko markatzen dute. Birusak, bakterioak eta bestelako agente infekziosoak ezagutzeko ez ezik, gai dira immunitate-sistema minbizi-zelulen aurka bideratzeko ere. Edo, zelula osasuntsuen egituretara lotzen badira, kalte egin diezaiekete, eta horrek gaixotasun autoimmuneak garatzea ekarri.

B linfozitoek antigorputzak jariatzen dituzte ezezaguntzat duten zerbait, antigeno deritzoguna, hautematen dutenean. B linfozitoek antigeno ugariren aurkako antigorputzak sor ditzakete —bilioi bat desberdin sortzeko aukera dugu!—, non B zelula-mota edo klon bakoitzak antigeno zehatz bat ezagutzen duen. B linfozito-klon bakoitzak antigorputz-mota bakarra ekoizten du; antigorputz monoklonal deritzegunak dira¹.

Egituraren aldetik, antigorputzak bi unitate berdinez, bi monomeroz, osatuta daude, eta monomero bakoitzak bi kate ditu: kate arin laburra eta kate astun luzea. Funtzioaren aldetik, bi ataletan banatu ditzakegu proteina hauek. Alde batetik, antigenoa espezifikoki lotzen duen atala dago, Fab (fragment antigen-binding) deiturikoa. Bestetik, Fc (fragment crystallizable) atala immunitate-sistemako beste elementuekin lotzen da erantzun immunea pizteko² (1. irudia).

Immunoterapiaren mundua

Demagun norbait ez dela gai bere kabuz erantzun immune sendoa ekoizteko, edo patogeno batekin kontaktuan egoteko arriskua duela. Pertsona hauei odolaren bitartez zuzenean antigorputz monoklonalak eman ahal zaizkie, erantzun immunea azkar gauzatzeko, immunitate-sistemaren bide ezberdinak aktibatzeko edo blokeatzeko… pazientearen beharren arabera. Horretan datza immunoterapia. Gaur egun, minbiziaren aurkako immunoterapia gailentzen da, klinikan erabiltzen diren antigorputzen % 46 izanda. Hala ere, immunitate-sistemarekin erlazionatutako gaitzak tratatzeko antigorputzak ere ugariak dira, % 27. Gaixotasun infekziosoak edo kardiobaskularrak tratatzeko ere erabiltzen dira, besteak beste³ (1. irudia).

Antigorputz monoklonalak hainbat gaitzentzat erabilgarriak direnez, ez da harritzekoa farmazia-industriaren interesa piztu izana. Izan ere, terapia berria ez bada ere, azken urteotan merkatuan gehien zabaldu diren sendagaien artean daude⁴. Beraz, antigorputz berrien aurkikuntza gaurkotasun betean dago. Baina nola bilatzen dira?

Antigorputzen bila

Antigorputzak aurkitzeko tekniketan lehena hibridoma teknologia da (2. irudia). 1975ean sortu zuten Georges JF. Kohler eta Cesar Milstein ikerlariek, eta, oraingoz, ospitaleetan erabiltzen diren antigorputz gehienak metodo horren bidez aurkitu dira. Teknika horretan, laborategiko animaliak, saguak batez ere, intereseko antigenoarekin immunizatzen dira haren aurkako erantzun immunea pizteko (2A irudia-1. pausoa). Ostean, animaliaren barea jaso eta bertan dauden B linfozito aktiboak, antigorputzak ekoizten dituzten zelulak alegia, isolatzen dira (2A irudia-2. pausoa). B linfozitoak, orduan, laborategian hazten dira mieloma-zelulekin batera, zeinek, minbizi-zelulak izanda, etengabeko hazkuntza ahalbidetzen baitute. Zelula-kultiboaren baldintzak direla eta, mieloma-zelulen eta B linfozitoen arteko fusioa bultzatzen da hibridoma deituriko zelulak osatuz (2A irudia-3. pausua). Hibridoma bakoitzak antigorputz-mota bakarra ekoiztuko du. Azkenik, antigenoa hobekien ezagutzen duten antigorputzak sintetizatzen dituzten hibridomak hautatuko dira⁵ (2A irudia-4. pausoa).

Baina metodoak hainbat desabantaila ditu. Esaterako, sortzen diren antigorputzak sagu-jatorrikoak direla. Hortaz, zenbait estrategia bilatu dira antigorputz horiek gizatiartzeko, hala nola gizatiartutako immunitate-sistema duten sagu transgenikoak erabiltzea⁶. Edonola ere, hibridomak sortzeko prozesua luzea eta etekin oso baxukoa da, non soilik hibridomen % 1ek iraungo duen bizirik⁵. Mugak eta ikuspegi etikoa kontutan izanda, laborategiko animalien erabilera saihesten duten metodoak sortu ziren. Haien artean nabarmenena antigorputz-bilduma handia birusen gainazalean aurkeztean oinarritzen dena da: phage display (2. irudia).

Birusak antigorputzen aurkezle

Phage display teknologia ez da berria, 80ko hamarkadan sortu baitzen. Teknika honen muina bakterioak infektatzen dituen M13 bakteriofagoa, birus bat, da. Fago honek pIII izeneko proteina bat dauka bere gainazalean. Proteina horren geneari gure intereseko proteina baten genea lotzen badiogu, pIII eta gure proteina batera espresatuko dira birusaren kanpoaldean infektatzeko gaitasunari kalterik egin gabe. Horrenbestez, antigorputz ezberdinak aurkezten dituzten fago-bilduma bat sortu dezakegu, eta horietatik gure intereseko itua, antigenoa, detektatzeko gai direnak aukeratuko ditugu. Baina nondik atera dira antigorputz hauek?

Antigorputz liburutegien iturriak

Estrategietako bat antigeno jakin batekin immunizatutako pertsonetan oinarritzen da; adibidez, COVID-19a izan edo txertoa jaso dutenak. Behin antigenoaren kontrako erantzuna sortuta, aktibatutako B linfozitoak jaso (2B irudia-1. pausoa) odol-lagin batetik, eta klon bakoitzak ekoiztutako antigorputz monoklonalaren sekuentzia espezifikoa eskuratzen da PCR bidez. Gero, sekuentzia guztiak pIII proteinaren genera batzen dira ausaz, antigorputz-sekuentzia bakoitzeko pIII-antigorputz molekula bat izanik. Azkenik, pIII-antigorputz sekuentzien bilduma bakterioen barruan sartzen da, fagoak ekoizteko beharrezkoak diren beste geneekin batera; hau da, bakterioak “artifizialki infektatzen” ditugu. “Infektatutako” bakterioek, orduan, gainazalean pIII-antigorputz jakina duten fagoak sortuko dituzte (2B irudia-2. pausoa). Antigorputz-liburutegi mota honi liburutegi immune deritzogu, eta intereseko antigeno bakoitzeko liburutegi bat osatzen da^1,6.

Antigeno espezifiko baten aurka ekoizten diren liburutegiei kontrajarrita, naïve liburutegiak osasuntsu edo gaitz jakinik gabeko gizakien B linfozitoetatik ekoizten dira. Hau da, liburutegi-mota honetan ez da antigeno bakarraren aurkako erantzun immunea gailentzen; moldakorragoak dira^1,6. Edonola ere, antigeno zehatz baten aurkako erantzuna garatu ez delako, hain zuzen ere, naïve liburutegietatik lortzen diren antigorputzek orokorrean afinitate baxuagoa dute liburutegi immuneetatik eskuratzen direnek baino. Beraz, ostean afinitatea hobetzeko estrategiak erabili ohi dira⁸.

Antigorputz-liburutegia zenbat eta askotarikoagoa izan, orduan eta aukera gehiago gure intereseko antigenoaren aurkako baten bat topatzeko. Ideia honekin liburutegi sintetikoak sortu ziren. Kasu honetan, liburutegi bateko antigorputz monoklonal moten kopurua artifizialki handitzen da. Horretarako, antigenoa ezagutzeaz arduratzen diren eremuen sekuentziak laborategian ausaz edo ezaugarri jakinak betetzeko aldatzen dira, eta naturan berez existitzen ez diren antigorputzak lor daitezke⁶.

Kasu batean edo bestean, antigorputzak fagoaren gainazalean aurkezten dira. Fago bilduma itu antigenoarekin kontaktuan jartzen da, eta hari lotuta geratzen diren fagoak aukeratzen dira (2B irudia-3. pausoa). Prozesu hori hiruzpalau aldiz errepikatzen da, gero eta baldintza zorrotzagoak jarriz batuketarako. Horri esker, bakarrik antigenoarekiko afinitate altua duten —antigenoa hobekien ezagutzen duten— antigorputz espezifikoak identifika daitezke (2B irudia-4. pausoa)^1,2,6,7.

Antigorputz bat, hamaika forma

Antigorputzetan pentsatzean, Y forma duten proteinetan pentsatu ohi dugu. Eta hala bada ere gizakien antigorputz gehienen kasuan, adibidez IgG motakoetan (1. irudia), molekula hauek konplexuegiak dira fagoen gainazalean aurkezteko. Izan ere, fagoak ekoizten dituzten bakterioek ezin dituzte IgGak bezalako molekula konplexuak ekoiztu. Hortaz, phage displayan soilik IgGen atal batzuk erabiltzen dira. Horietako bat antigenoa ezagutzen duen atala da, hots, Fab-a. Fab-ak bi katez osatuta daude, non kate bakoitzak atal konstantea eta atal aldakorra dituen (1. irudia). Baina antigorputz-liburutegien ekoizpena erraztearren, kate bakarreko formatuak lortu dira. Haien artean erabilienak soilik bi kateen atal aldakorrak elkarri lotuta dituzten single-chain fragment variable deritzenak (scFv-ak) dira^1,9,10 (1. irudia). Hala ere, beste hainbeste formatu erabiltzen dira, kamelidoetatik eskuratzen diren antigorputz-zati txiki eta bitxiak, nanobodyak, besteak beste¹¹.

Phage displaytik harago

Phage display teknologiak zenbait muga ditu, hautatutako antigorputzen baten porrota eragin dezaketenak. Alde batetik, prozesuaren hasieran scFv edo Fab formatuetan lan egin ohi da, zeinak bakterioetan ekoizten baitira. Baina normalean antigorputzak IgG moduan erabiltzen dira klinikan; ugaztun-zeluletan produzitzen direnak dira. Horrenbestez, formatu eta ekoizpen-modua aldatu behar dira, antigorputzen egituran eta ezaugarrietan kaltegarria izan daitezkeenak.

Fagoen ordez IgGak osorik aurkeztu ditzaketen organismo konplexuagoak erabiltzea proposatu da, legamiak kasu (yeast display). Halere, phage displayarekin alderatuta, prozesuaren etekina baxuagoa da eta antigorputz-liburutegiak ez dira hain askotarikoak¹². Beste aukera bat zuzenean ugaztun-zelulak erabiltzea izan daiteke (mammalian display). Baina IgG egokiak aurkezten dituzten zelula-bildumak osatu ahal badira ere, egungoak txikiak dira eta horretarako prozesua oso garestia eta zaila da¹².

Bestetik, phage displayan soilik antigenoa ezagutzeko gaitasuna kontuan hartzen da antigorputzak aukeratzerako orduan, bestelako ezaugarriak, egonkortasuna kasu, aintzat hartu gabe¹³. Azken urteotan, tresna informatiko asko sortu dira antigorputzen ezaugarriak aurresateko. Beraz, antigorputz egokienak aukeratzen lagundu dezakete¹⁴.

Hortaz, birusak eta minbizi-zelulak beti etsaitzat izan baditugu ere, 40 urtez ezinbesteko laguntzaileak izan dira antigorputz berriak topatzeko.

Bibliografia

1. Nur A. et al. 2023. "Antibody Phage Display". Phage Display: Methods and Protocols, Springer US, New York, NY.

2. Lu R.M. et al. 2020. "Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases". J. Biomed. Sci. 27, 1.

3. YAbS. https://db.antibodysociety.org/

4. Antibody Therapy Market Size, Growth Analysis 2023-2032. Global Market Insights Inc. https://www.gminsights.com/industry-analysis/antibody-therapy-market.

5. Mitra S. eta Tomar P.C. 2021. "Hybridoma technology; advancements, clinical significance, and future aspects". J. Genet. Eng. Biotechnol. 19, 159.

6. Geyer C.R., McCafferty J., Dübel S., Bradbury A.R.M. eta Sidhu S.S. 2012. "Recombinant Antibodies and In Vitro Selection Technologies". Antibody Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ.

7. Zhang Y. 2023. "Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery". mAbs 15, 2213793.

8. Lim C.C., Choong Y.S. eta Lim T.S. 2019. "Cognizance of Molecular Methods for the Generation of Mutagenic Phage Display Antibody Libraries for Affinity Maturation". Int. J. Mol. Sci. 20, 1861.

9. Huston J.S. et al. 1988. "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 5879–5883.

10. Bates A. eta Power C A. 2019. "David vs. Goliath: The Structure, Function, and Clinical Prospects of Antibody Fragments". Antibodies 8, 28.

11. Khodabakhsh F., Behdani M., Rami A. eta Kazemi-Lomedasht F. 2018. "Single-Domain Antibodies or Nanobodies: A Class of Next-Generation Antibodies". Int. Rev. Immunol. 37, 316–322.

12. Slavny P. et al. 2024. "Advancements in mammalian display technology for therapeutic antibody development and beyond: current landscape, challenges, and future prospects". Front. Immunol. 15, 1469329.

13. Kasana A., Kapoor K. eta Verma V. 2025. "From Phage Surface to Bedside: Development of Therapeutic Monoclonal Antibodies using Phage Display". Curr. Pharmacol. Rep. 11, 54.

14. Zheng J., Wang Y., Liang Q., Cui L. eta Wang L. 2024. "The Application of Machine Learning on Antibody Discovery and Optimization". Molecules 29, 5923.