Bilatzailea
Virus e células cancerosas, compañeiros casuais na procura de anticorpos
Para infeccións, cancro, enfermidades autoinmunes… As terapias baseadas en anticorpos aumentaron nos últimos anos. Pero, como se atopan os anticorpos que se usarán nos hospitais? Aínda que pode soar raro, a resposta ten que ver coas células cancerosas e os virus.
Que e como son os anticorpos?
Os anticorpos son un dos eixos das defensas do noso corpo, coñecen ao intruso e márcano para eliminar os sistemas inmunitarios. Non só son capaces de recoñecer virus, bacterias e outros axentes infecciosos, senón que tamén son capaces de dirixir o sistema inmunitario contra as células cancerosas. Ou, si únense a estruturas de células sas, poden danalas, o que leva ao desenvolvemento de enfermidades autoinmunes.
Os linfocitos B segregan anticorpos cando perciben algo que consideran descoñecido, o que chamamos antígeno. Os linfocitos B poden producir anticorpos contra numerosos antígenos —temos a posibilidade de producir un billón de diferentes!— onde cada tipo celular B ou clon recoñece un antígeno específico. Cada clon de linfocitos B produce un único tipo de anticorpos, os denominados anticorpos monoclonales 1.
Estruturalmente, os anticorpos están formados por dúas unidades iguais, dous monómeros, cada un dos cales ten dúas cadeas: a cadea lixeira curta e a cadea pesada longa. Funcionalmente, podemos dividir estas proteínas en dous partes. Por unha banda, atópase a sección que une especificamente o antígeno, chamada Fab (fragment antigen-binding). Doutra banda, a sección FC (fragment crystallizable) asóciase con outros elementos do sistema inmunitario para desencadear a resposta inmune 2 (Figura 1).
O mundo da inmunoterapia
Supoñamos que alguén non é capaz de producir unha resposta inmune forte en por si, ou que corre o risco de estar en contacto cun patóxeno. A estas persoas pódenselles administrar anticorpos monoclonales directamente a través do sangue, co fin de levar a cabo rapidamente a resposta inmune, activar ou bloquear diferentes vías do sistema inmunitario… en función das necesidades do paciente. Niso consiste a inmunoterapia. Na actualidade, prevalece a inmunoterapia contra o cancro, que representa o 46 % dos anticorpos utilizados na clínica. Con todo, tamén son abundantes os anticorpos para o tratamento de afeccións relacionadas co sistema inmunitario, cun 27%. Tamén se utilizan para tratar enfermidades infecciosas ou cardiovasculares, entre outras 3 (Figura 1).
Dado que os anticorpos monoclonales son útiles para unha variedade de afeccións, non é de estrañar que se espertou o interese da industria farmacéutica. E é que, aínda que non se trata dunha terapia nova, 4 dos medicamentos máis estendidos no mercado nos últimos anos. Por tanto, o descubrimento de novos anticorpos está en plena actualidade. Pero, como se buscan?
Buscando anticorpos
A primeira das técnicas de localización de anticorpos é a tecnoloxía hibridoma (Figura 2). georges JF foi fundada en 1975. Os investigadores Kohler e César Milstein, e, polo momento, a maioría dos anticorpos que se utilizan nos hospitais descubríronse por este método. Nesta técnica, os animais de laboratorio, especialmente os ratos, se inmunizan con antígeno de interese para desencadear unha resposta inmune contra el (figura 2A-1. Paso). A continuación, recóllese o bazo do animal e íllanse os linfocitos B activos presentes, as células produtoras de anticorpos (figura 2A-2. Paso). Os linfocitos B crecen entón no laboratorio xunto coas células de mieloma, que sendo células cancerosas permiten un crecemento continuo. Debido ás condicións do cultivo celular, favorécese a fusión das células de mieloma cos linfocitos B formando as denominadas hibridomas (Figura 2A-3. o paso). Cada hibridoma producirá un único tipo de anticorpo. Finalmente, seleccionaranse as hibridomas que sintetizan os anticorpos que mellor coñecen o antígeno 5 (Figura 2A-4. Paso).
Pero o método ten varias desvantaxes. Por exemplo, que os anticorpos que se producen son de orixe rato. Por tanto, buscáronse estratexias para humanizar estes anticorpos, como o uso de ratos transxénicos con sistema inmunitario humanizado 6. En calquera caso, o proceso de xeración de hibridomas é longo e de moi baixo rendemento, onde só o 1% dos hibridomas sobrevivirá 5. Tendo en conta as limitacións e o enfoque ético, creáronse métodos que evitan o uso de animais de laboratorio. O máis destacado deles é o que se basea na presentación da gran colección de anticorpos sobre a superficie dos virus: phage display (Figura 2).
Os virus como presentadores de anticorpos
A tecnoloxía phage display non é nova, xa que se remonta aos anos 80. O núcleo desta técnica é o bacteriófago M13, un virus, que infecta as bacterias. Este fago contén unha proteína chamada pIII na súa superficie. Se unimos ao xene desta proteína o xene dunha proteína do noso interese, o pIII e a nosa proteína expresaranse xuntos sen prexudicar a capacidade de infectarse no exterior do virus. Así pois, podemos crear unha colección de fagos que presenten diferentes anticorpos, dos cales seleccionaremos aqueles capaces de detectar a nosa diana de interese, o antígeno. Pero, de onde saíron estes anticorpos?
Fontes de bibliotecas anticorpos
Unha das estratexias baséase nas persoas inmunizadas cun antígeno en particular, por exemplo, aquelas que tiveron COVID-19 ou que foron vacinadas. Unha vez producida a resposta antigénica, recoller os linfocitos B activados (Fig. 2B-1. paso) Obtense mediante PCR unha secuencia específica do anticorpo monoclonal producido por cada clon dunha mostra de sangue. Logo, todas as secuencias únense aleatoriamente ao xene da proteína pIII, sendo unha molécula de pIII-anticorpo por secuencia de anticorpos. Finalmente, a colección de secuencias pIII-anticorpo inclúese dentro das bacterias, xunto cos outros xenes necesarios para a produción de fagos, é dicir, “infectamos artificialmente” as bacterias. As bacterias “infectadas” producirán entón fagos con pIII-anticorpo na superficie (figura 2B-2. Paso). Este tipo de biblioteca de anticorpos denomínase biblioteca inmune, constituíndo unha biblioteca por cada antígeno de interese 1,6.
En contraposición ás bibliotecas que se producen contra un antígeno específico, as bibliotecas naïve prodúcense a partir de linfocitos B de humanos sans ou sen doenzas determinadas. É dicir, neste tipo de bibliotecas non prevalece a resposta inmune ao antígeno único, senón que son máis versátiles 1,6. En calquera caso, precisamente porque non se desenvolveu unha resposta contra un antígeno específico, os anticorpos que se obteñen das bibliotecas naïve teñen xeralmente unha afinidade máis baixa que os que se obteñen das bibliotecas inmunes. Por tanto, adóitanse utilizar estratexias para mellorar a afinidade 8.
Canto máis variada sexa a biblioteca de anticorpos, maiores serán as posibilidades de que nos atopemos con algún antígeno do noso interese. Con esta idea creáronse bibliotecas sintéticas. Neste caso, o número de tipos de anticorpos monoclonales nunha biblioteca aumenta artificialmente. Para iso, as secuencias das áreas responsables do recoñecemento do antígeno modifícanse aleatoriamente no laboratorio ou para cumprir determinadas características, e poden obterse anticorpos que non existen naturalmente na natureza 6.
Nun ou outro caso, os anticorpos preséntanse na superficie do fago. A colección de fagos entra en contacto co antígeno itu e selecciónanse os fagos que quedan unidos a el (Fig.2B-3. Paso). Este proceso repítese tres ou catro veces, con condicións cada vez máis estritas para a suma. Isto permite identificar anticorpos específicos que só teñen unha alta afinidade polo antígeno —os que mellor o coñecen— (figura 2B-4. Fase)1,2,6,7.
Un anticorpo, once formas
Ao pensar en anticorpos, adoitamos pensar en proteínas con forma de E. Con todo, na maioría dos anticorpos humanos, como os de tipo IgG (Fig. 1), estas moléculas son demasiado complexas para presentarse na superficie dos fagos. Isto débese a que as bacterias produtoras de fagos non poden producir moléculas complexas como as IgG. Por tanto, no phage display só se utilizan algunhas seccións de IgG. Unha delas é a parte que coñece o antígeno, é dicir, o Fab. Os fab están formados por dúas cadeas, cada unha das cales ten unha sección constante e unha sección variable (Figura 1). Pero co fin de facilitar a produción de bibliotecas de anticorpos, obtivéronse formatos dunha soa cadea. Os máis utilizados son os denominados -chain fragment variable (scFv), nos que só se atopan unidas as partes variables das dúas cadeas (figura 1) 1,9,10. Con todo, utilízanse outros tantos formatos, como pequenos e estraños fragmentos de anticorpo obtidos dos camélidos, nanobody, entre outros 11.
Máis aló do phage display
A tecnoloxía phage display ten certas limitacións que poden provocar o fracaso dalgún anticorpo seleccionado. Por unha banda, ao comezo do proceso adóitase traballar nos formatos scFv ou Fab, que se producen en bacterias. Pero normalmente os anticorpos utilízanse como IgG na clínica; son os que se producen nas células de mamíferos. Por tanto, é necesario cambiar o formato e o modo de produción, que poden ser prexudiciais para a estrutura e as características dos anticorpos.
Propúxose a substitución de fagos por organismos máis complexos que poidan presentar as IgG completas, como os fermentos (yeast display). Con todo, en comparación co phage display, o rendemento do proceso é máis baixo e as bibliotecas de anticorpos son menos variadas 12. Outra opción pode ser o uso directo de células de mamíferos (mammalian display). Con todo, aínda que é posible completar coleccións celulares que presenten IgG axeitadas, as actuais son pequenas e o proceso para iso é moi custoso e difícil 12.
Doutra banda, no phage display só se ten en conta a capacidade de recoñecer o antígeno á hora de elixir anticorpos, sen ter en conta outras características como a estabilidade 13. Nos últimos anos, creáronse moitas ferramentas informáticas para predicir as características dos anticorpos. Por tanto, poden axudar a elixir os anticorpos máis axeitados 14.
Por tanto, aínda que os virus e as células cancerosas sempre foron considerados inimigos, durante 40 anos foron colaboradores indispensables para atopar novos anticorpos.
Bibliografía
1. Nur A. Et ao. 2023. "Antibody Phage Display". Phage Display: Methods and Protocols, Springer US, Nova York, NY.
2. Lu R.M. Et ao. 2020. "Development of therapéutic antibodies for the treatment of diseases". J. Biomed. Sci. 27, 1.
3. YAbS. https://db.antibodysociety.org/
4. Antibody therapy Market Size, Growth Analysis 2023-2032. Global Market Insights Inc. https://www.gminsights.com/industry-analysis/antibody-therapy-market.
5. Mitra S. e Tomar P.C. 2021. "Hybridoma technology; advcements, clinical significance, and future aspects". J. Genet. Eng. Biotechnol. 19, 159.
6. Geyer C.R J. McCafferty, Dübel S., Bradbury A.R.M e Sidhu S.S. 2012. "Recombinant Antibodies and In vitro Selection Technologies". Antibody Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ.
7. Zhang e. 2023. "Evolution of phage display libraries for therapéutic antibody discovery". MAbs 15, 2213793.
8. Lim C.C., Choong E.S. e Lim T.S. 2019. "Cognizance of Molecular Methods for the Generation of Mutagenic Phage Display Antibody Libraries for Affinity Maturation". Int. J. Mol. Sci. 20, 1861.
9. Huston J.S. Et ao. 1988. "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin singles-chain Fv analogue produced in Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. a. 85, 5879–5883.
10. Bates A. e Power C A. 2019. "David vs. Goliath: The Structure, Function, and Clinical Prospects of Antibody Fragments". Antibodies 8, 28.
11. Khodabakhsh F., Behdani M., Rami A. e Kazemi-Lomedasht F. 2018. "Singles-Domain Antibodies or Nanobodies: A Class of Next-Generation Antibodies". Int. Rev. Inmunol. 37, 316–322.
12. Slavny P et ao. 2024. "Advcements in mammalian display technology for therapéutic antibody development and beyond: current landscape, challenges, and future prospects". Front. Inmunol. 15, 1469329.
13. Kasana A., Kapoor K. e Verma V. 2025. "From Phage Surface to Bedside: Development of Therapéutic Monoclonal Antibodies using Phage Display". Curr. Pharmacol. Rep. 11, 54.
14. J. Zheng, E Wang, Liang Q Cui L. e Wang L. 2024. "The Application of Machine Learning on Antibody Discovery and Optimization". Molecules 29 5923.
Buletina
Bidali zure helbide elektronikoa eta jaso asteroko buletina zure sarrera-ontzian
