O ADN antigo, novo campo de investigación

2002/03/01 Andonegi Beristain, Garazi - Elhuyar Zientziaren Komunikazioa Iturria: Elhuyar aldizkaria

• Genetika

Neste encontro de dous días déronse a coñecer os descubrimentos de cada grupo e analizouse o futuro da investigación do antigo ADN. Entre os participantes atopábase a profesora e investigadora do campus de Leioa da UPV, Conchi da Rúa, con quen puidemos manter una conversación. El explicounos as investigacións que se levaron a cabo nun mundo único e a súa experiencia.

Que é o ADN antigo?

A maior parte do material xenético dun organismo almacénase no núcleo da célula como cromosoma. Os cromosomas están formados por 3.000 millóns de nucleótidos que codifican entre 50.000 e 100.000 xenes. “Con todo, a maior parte da cadea de ADN non é un codificador de xenes e este carácter neutro fai que o ADN sirva paira a investigación xenética”, explica Conchi.

Se comparamos o ADN antigo co ADN dos seres vivos, hai algunhas diferenzas notables. En primeiro lugar, a cantidade de ADN antigo que se obtén nas extraccións é moi baixa respecto da que se pode obter dun vivo, entre 0,1 e 1%. E en segundo lugar, a cadea de ADN resultante está fragmentada en cadeas de 100 pares de bases, mentres que en seres vivos pódense obter cadeas de miles de pares de bases.

Estas diferenzas débense aos procesos de degradación que se producen nas mostras. “Os efectos de oxidación e hidrólisis que se producen tras a morte do organismo provocan a ruptura da cadea de ADN, sendo de gran importancia a conservación do organismo paira a calidade das mostras nunha contorna seca e sen osíxeno”, explica. Por este motivo, a idade límite do ADN antigo sitúase en 100.000 anos.

ADN mitocondrial

Debido ao escaso número de antigas moléculas de ADN recuperadas, a maioría dos investigadores dirixíronse a traballar con ADN mitocondrial no caso do antigo ADN. Como o ADN nuclear é único en cada célula, o ADN mitocondrial é abundante. Esta abundancia aumenta a supervivencia e as posibilidades de recuperación do ADN.

No caso da mitocondria, a lonxitude da cadea de ADN é de 16.500 pares de bases nitrogenadas, o que supón o 0,0005% do xenoma humano. O ADN das mitocondrias humanas e de varios vertebrados está secuenciado e nesta secuencia atópase una zona denominada área de control. Esta zona equivalente en base 1.100 é neutra, de maneira que as mutacións só aparecen baixo a influencia do tempo e non pola selección natural. Ademais, o punto de control soporta o 90% das mutacións de ADN mitocondrial.

A estas particularidades hai que engadir outra: O ADN mitocondrial só se recibe da súa nai. “O ADN mitocondrial atópase na cola dos espermatozoides, e durante a fecundación do óvulo a cola queda fóra –di Conchi–, quedando así fose o ADN mitocondrial masculino”.

Isto supón reducir á metade a área de estudo e facilitar o seguimento da marca de deriva xenética.

Iniciación

A primeira investigación do ADN antigo realizárona en 1984 cun animal que desapareceu fai 150 anos. Una antiga secuencia de ADN obtívose por primeira vez do tecido muscular seco dun equus quagga. Desta secuencia, demostraron a relación evolutiva entre o quagga e os parentes máis próximos de hoxe, a cebra.

Un ano despois, en 1985, outros investigadores recuperaron o ADN das células superficiais das momias. Das 110 momias seleccionadas, 23 estaban mellor conservadas e só dúas delas obtiveron ADN. Este paso foi o inicio do estudo do antigo ADN humano.

Continuando coas investigacións, a mediados da década dos 90 conseguiuse secuenciar fragmentos de ADN de vertebrados xa desaparecidos, como o Thylacinus ou o lobo martsupial (120 anos), o Smilodón ou tigre ‘con dentes de sabre’ (14.000 anos), o mamut escuro (10.000-50.000 anos) e o model (3.300 anos).

Ademais, estudouse una folla de magnolia chamada Ma (17 millóns de anos) e varios insectos almacenados no ámbar, pero os seus estudos non se consideran actualmente fiables. “Non se conseguiu repetir os resultados obtidos nestes laboratorios nin no mesmo nin noutros, o que invalida os resultados”, afirma Conchi. “Con todo, quedou demostrado que o ADN antigo era recuperable”.

En 1986 dáse un paso máis importante ao lanzar o novo método de análise PCR. Esta técnica revolucionou a investigación do ADN e permitiu o descubrimento dos xenes mitocondriales.

Método PCR

A reacción en cadea ou método PCR da polimerasa consiste en sintetizar millóns de copias dun pequeno fragmento de ADN. Neste proceso cíclico

Parte da cadea de ADN duplícase exponencialmente até dispor de mostras suficientes paira aplicar os diferentes métodos de análises. O PCR require o deseño de cadeas de ADN curtas con función limitante, complementarias da cadea de ADN obxecto de estudo. A función destes limitadores é fixar a lonxitude da cadea de ADN a duplicar, xa que se engaden ao principio e ao final. A continuación, a encima denominada Taq polimerasa realiza a dobraxe da cadea de ADN.

Así, o método PCR permitiu ampliar os estudos a ósos e dentes e, ao ser un material corrente procedente de escavacións arqueolóxicas, abriuse a porta ao estudo da historia biolóxica dos séculos.

Problemas metodológicos e contaminación

Con todo, a capacidade de duplicación do método PCR convértese nun problema no caso do antigo ADN. O ADN antigo ten un alto risco de contaxio ao entrar en contacto con calquera elemento externo. Tendo en conta isto, e dado que as antigas cadeas de ADN que se recuperan son curtas, o método de PCR ten una gran probabilidade de copiar fragmentos de ADN externos. Por iso, é imprescindible adoptar una serie de medidas paira asegurar o resultado da dobraxe.

En primeiro lugar, débese asegurar o illamento físico do laboratorio para que non afecte a elementos externos; en segundo lugar, débese utilizar unicamente o equipamento destinado á recuperación do ADN antigo e, finalmente, débese asegurar a total esterilidad das mostras a utilizar. Estas mostras adóitanse extraer dos grans que mellor se conservan, xeralmente usando ósos e dentes. “A cantidade de ADN antigo dispoñible extraído da pulpa é maior que a que se obtén do resto de tecidos ou ósos, e ademais nos xacementos adoita ser una peza común”.

Ademais de todas as medidas mencionadas, os estudos deben repetirse tanto no mesmo laboratorio como en diferentes laboratorios, utilizando máis dunha mostra do mesmo exemplar, o que asegura a existencia ou non de contaminación. Finalmente, paira homologar a antiga secuencia de ADN, débese comparar co universo de secuencias coñecidas que se almacenan nas bases de datos, analizando posteriormente os resultados nun contexto filogenético adecuado e comparándoos coas secuencias doutras especies vivas ou mortas dun mesmo grupo taxonómico.

Que métodos utilizades paira os exames?

“Pódense utilizar dous métodos, uno de secuenciación e outro de análises de encimas restritivas”.

A secuenciación é coñecer a localización das bases nitrogenadas responsables da información xenética na cadea de ADN. Este método automático con varios pasos consiste nunha amplificación especial da cadea de ADN, onde se obteñen fragmentos fluorescentes de diferentes tamaños. A continuación distribúense mediante electroforesis, é dicir, sepáranse entre si nun xel sobre o que se aplica un campo eléctrico. A velocidade de migración depende do tamaño. Neste proceso un lector láser detecta a emisión fluorescente de cada parte, que depende da última base nitrogenada que se engadiu no proceso de PCR. En consecuencia, coñécese a base nitrogenada en función da fluorescencia que se desprenda.

Coas encimas restritivas analízanse as secuencias de destinos. “As secuencias de meta son cadeas curtas de par nitrogenado na cadea ADN”. As encimas restritivas son capaces de romper a cadea de ADN desde onde se atopan as secuencias de destino. Estas secuencias de meta, que teñen una lonxitude de 4-6 pares de bases nitrogenadas (pb), son diferentes paira cada encima reductora, é dicir, una encima reductora debe atopar una secuencia de metas paira poder romper a cadea de ADN, que en moitas ocasións non existe. “Vendo se a cadea ADN reacciona ou non con diferentes encimas, podemos saber si ten diferentes secuencias de destino e si trátase ou non de secuencias de destino, segundo os diferentes patróns existentes, podemos ver xenéticos relacionales”. Metodológicamente esta segunda técnica é máis sinxela e rápida, o que permite obter máis resultados positivos.

Futuro próximo

Nos últimos anos a investigación do ADN antigo centrouse na procura de relacións filogenéticas, no estudo da variabilidade xenética ao longo do tempo ou na investigación de cambios demográficos. Todo iso débese aos avances en bioloxía molecular e ao desenvolvemento da técnica PCR. Con todo, aínda quedan obstáculos como o risco de contaminación e a mala conservación do ADN antigo.

De face ao futuro, o estudo está orientado a mellorar a metodoloxía de extracción do ADN e a aumentar o número de mostras antigas. Ademais, as novas investigacións centraranse en profundar na investigación do ADN nuclear. Estes indicadores permitirán non só analizar a información recibida da súa nai, senón tamén a do seu pai. O futuro daranos o límite desta ciencia?

I España do ADN antigo. Congreso Na Residencia da Vidreira da Universidade Autónoma de Madrid, situada en Miraflores de la Sierra, celebrouse a I Edición Española do ADN antigo. Congreso. Entre os invitados atopábanse expertos de 15 centros de investigación dedicados á bioloxía evolutiva, paleobiología, antropoloxía, xenética molecular, forense e ictología. Estes grupos de investigadores expuxéronse coñecer e profundar nos obxectivos comúns da súa ciencia. Entre estes obxectivos analizouse a creación dun grupo de traballo sobre o ADN antigo. Este grupo encargaríase de establecer un procedemento básico paira garantir a calidade das investigacións nesta ciencia. Outro dos obxectivos era reforzar as relacións entre laboratorios, impulsando a colaboración entre os grupos investigadores. Por último, comentouse a intención de dar a coñecer as potenciais aplicacións deste campo científico para que a xente teña en conta as posibles aplicacións da investigación do ADN antigo noutros campos.

Que hai en Euskal Herria?

Conchi da Rúa e o seu equipo dirixen as súas investigacións á antropoloxía. O método das encimas restritivas ha permitido clasificar o 97% das mostras libres de contaminación de diversos xacementos vascos. Aínda que a porcentaxe parece alto, hai que dicir que tan só o 25% das mostras recuperadas están representadas, xa que só se analizaron os dentes en perfecto estado paira evitar o risco de contaminación.

Entre os descubrimentos obtivéronse datos paira oporse ás teorías dalgúns investigadores italianos. Estes investigadores italianos informaban sobre un grupo que fai entre 10.000 e 15.000 anos estendeuse desde o País Vasco a Europa. O obxectivo desta teoría era explicar a abundancia dun grupo xenético existente actualmente na sociedade vasca, o denominado V Haplotalde. Os traballos dos investigadores vascos han demostrado que existe a ausencia deste grupo nas mostras de ADN antigas, é dicir, que non hai indicios desa época do haplotalde. Que significa isto? “Que este grupo de Haplots non se creou aquí porque se fóra de aquí debería aparecer en mostras con menos de 10.000 anos de antigüidade”.

Conchi e os seus compañeiros pon o punto de vista en derívaa xenética paira explicar a abundancia deste grupo. “A mutación que define o Haplotaldea puido alcanzar una taxa elevada nun grupo de poboación, como é o caso de Gipuzkoa, nunha época na que a poboación era reducida, e os crecementos de poboación posteriores permitiron ampliar dita mutación”.