Peixos, gens i xips: llibertat d'expressió davant la contaminació
2006/04/01 Cancio Uriarte, Ibon - Biologian doktorea | Bilbao Castellanos, Eider - Biokimikan lizentziatua Iturria: Elhuyar aldizkaria
(Foto: Laboratori de Peix Zebra de ZFIN i Oregon)
A mesura que augmenta la contaminació, cada vegada és major la necessitat de conèixer quins són els danys que aquests contaminants provoquen en els organismes, com condicionen el comportament de l'organisme i com poden preveure's aquests efectes. Per a l'estudi d'aquests danys, encara que els estudis s'han centrat en diversos nivells, els realitzats a nivell molecular s'han materialitzat, promogut i fet imprescindible en conèixer tota la seqüencia genòmica dels éssers eucariotes (mosca de fruita, cuc de terra o ésser humà).
La raó d'aquesta importància radica en la funció i característiques del propi genoma, que pot ser considerat com una biblioteca que alberga tota la informació (fenotip) per a formar cada organisme. Aquesta biblioteca està organitzada en llibres o gens que emmagatzemen informació per a produir proteïnes que compleixen la majoria de les funcions de la cèl·lula. Així, els canvis en els gens i/o en l'expressió d'aquests gens poden provocar alteracions en el funcionament normal de la cèl·lula.
Regulació de l'expressió gènica
Les diferències fenotípiques entre espècies (arquitectura corporal, metabolisme, comportament...) han d'entendre's en un doble nivell. D'una banda, cada espècie té la seva pròpia biblioteca (genoma); algunes espècies estan dotades de nombrosos llibres (gens) i altres menys. D'altra banda, i com acabem de conèixer, els genomes de l'home i del mico estan dotats de manera similar, per la qual cosa una altra cosa ha de condicionar les diferències notables entre aquestes dues espècies. En aquesta segona variable participa la regulació de l'expressió gènica.
En gran manera, els llibres que tenim a la biblioteca els llegim de l'una o l'altra manera. Això queda clar si mirem el nostre colco. Els éssers humans som éssers pluricel·lulars i, encara que totes les nostres cèl·lules tenen el mateix genoma, és difícil marcar les semblances entre un hepatòcit i una neurona, ja que les cèl·lules durant el desenvolupament, segons les condicions del mitjà, expressen (llegeixen) determinats gens (llibres). Per això, per a guanyar en la competició entre espècies utilitzem les vies metabòliques de cada moment, sempre amb l'objectiu d'obtenir el màxim rendiment energètic.
Per exemple, els habitants del primer món fem tres menjars al dia. Per tant, per a complir amb les nostres obligacions energètiques, d'una banda recorrem al metabolisme dels hidrats de carboni a través dels enzims de la glicolisis, però d'altra banda acumulem lípids a través de la producció de triglicèrids. Per això, no necessitem el catabolisme dels lípids fins que sentim gana. Quan s'inicia una vaga de fam, per exemple, els gens productors d'enzims procedents de les vies metabòliques que intervenen en el catabolisme dels triglicèrids comencen a expressar-se ràpidament. És el que es coneix com a regulació de l'expressió gènica.
Per a dur a terme aquesta regulació, els éssers pluricel·lulars estan dotats de proteïnes especials, factors de transcripció, que treballen en l'exploració contínua del mitjà cel·lular. La funció d'aquestes proteïnes és fer front als canvis que es produeixen en el mitjà (canvis en la concentració dels aliments, factors fisiològics, hormones, paràsits, malalties...) mitjançant canvis en l'expressió gènica.
Tots els compostos contaminants i tòxics presents en el mitjà són, per tant, una variable ambiental per a aquests factors de transcripció. Posarem un exemple: en la majoria dels animals es poden distingir exemplars masculins i femelles. Les principals diferències entre mascles i femelles depenen de dues hormones en la majoria de les espècies: la testosterona en els mascles i l'estradiol en les femelles. L'estradiol posa en marxa alternatives de desenvolupament representatives en les femelles mitjançant un factor de transcripció denominat receptor d'estrògens. Això provoca la producció de vitelogenina, la lipoproteïna de reserva més important dels ovòcits de les peixos femelles (també en altres grups). Produeixen peixos femelles, no mascles, encara que també tenen el gen que produeix vitelogenina.
En grans quantitats arriben als nostres rius composts amb una estructura química similar a l'estradiol, com els alquilfenoles de sabons utilitzats en les nostres neteges, els ftalats utilitzats en plàstics o les hormones artificials que prenem en les pastilles anticonceptives.
Aquests compostos transcriuen a través del receptor d'estrògens el gen que codifica la vitelogenina en els mascles. Però el gen de la vitelogenina no és l'únic que respon; els compostos estrogénicos daus a un mascle influeixen en l'expressió de centenars de gens. En conseqüència, existeixen en el món fluvial, on els peixos mascles produeixen proteïnes marcadores de les femelles, en les quals juntament amb els espermatozoides també s'han trobat ovòcits en alguns casos. Aquest exemple posa de manifest, per tant, els efectes significatius que sobre les poblacions de molts organismes poden tenir alguns compostos d'ús quotidià.
Toxicologia i genòmica junts
Un dels objectius actuals seria, per tant, conèixer les obligacions de tots aquests gens de diferents genomes en la cèl·lula. Encara que encara estem bastant lluny, any rere any coneixem el genoma de més organismes i coneixem cada vegada més clarament quins són els mecanismes de regulació de l'expressió gènica. Per tant, la toxicogenómica té com a objectiu investigar quins mecanismes de regulació de l'expressió gènica posen en marxa certs contaminants.
Se sap que no tots els individus exposats a contaminants ambientals responen de la mateixa manera. Aquesta resposta està limitada per factors interns del propi hoste (estat de desenvolupament, caràcter genètic, hormonal, metabòlic...) i ambientals (concentració del contaminant i temps d'exposició). Per tant, en funció de la combinació entre contaminant, presència de cofactors i sensibilitat genètica, dos individus o dues cèl·lules del mateix individu poden donar resposta diferent a un efecte determinat.
La resposta dels organismes davant una determinada substància tòxica és conseqüència de les interaccions de l'expressió de diferents gens. Per això, en els últims anys cada vegada són més els laboratoris que estan estudiant aquests gens. D'aquí va néixer la toxicogenómica.
En toxicogenómica, l'anàlisi de l'expressió gènica, a més d'informar sobre l'estat de les cèl·lules, ens mostra com responen aquestes cèl·lules davant diferents estímuls. Per tant, en primer lloc, hauríem de conèixer la seqüencia genòmica de l'organisme d'interès o, almenys, els aclaparaments en els quals les variables del mitjà poden expressar-se en excés o en excés i en quines vies metabòliques intervenen.
En els últims anys s'ha avançat enormement en aquest camp i és conegut en gran manera pels diferents tipus de compostos, com els que provoquen la inflamació, els compostos estrogénicos, els inmunosupresores o els carcinogénicos, que modifiquen l'expressió dels gens. Així, per exemple, quan parlem d'estrogenicidad, sabem que els principals gens a analitzar són els que codifiquen la vitelogenina (en els peixos) i les proteïnes de la matriu extracelul·lar de l'ou; quan parlem d'inmunosupresores, la interleucina, la proteïna del complement o diversos tipus de citocines; i quan parlem de carcinogénicos, juntament amb els genis Bcl-2, p53, c-myc, etc.
A l'hora de determinar quins són els gens a estudiar, el treball dels futurs toxicològics seria investigar els canvis expressius d'aquests gens enfront dels contaminants. No obstant això, en casos desconeguts, els toxicòlegs haurien de buscar nous gens que responguin a l'efecte del contaminant.
Ús de peixos en toxicogenómica ambiental
Dir que els peixos són els millors organismes a l'hora d'analitzar la toxicologia ambiental no és a dir massa, ja que aquests vertebrats tenen el cos submergit en l'aigua i, per tant, estan directament relacionats amb els contaminants presents en el mitjà, ja sigui a través de les brànquies o del sistema intestinal hepàtic. El grup de peixos és un grup ampli, tant en el nombre d'espècies com en el nombre d'individus dins de l'espècie, la qual cosa la converteix en un grup d'organismes amb diferents fisiologies, formes de vida i diversos sistemes d'adaptació.
Aquesta diversitat també es reflecteix en el genoma, ja que els peixos presenten un genoma molt més plàstic i canviant que uns altres vertebrats. Per tant, davant els canvis que es produeixen en el mitjà, la contaminació, especialment el peix, és més sensible que molts altres organismes. Així mateix, la utilització del peix com a model ens portarà a comprendre millor el genoma dels mamífers a l'hora d'interpretar els genomes d'altres tàxons. A més, cal no oblidar que moltes espècies de peixos, a més de la seva importància ecològica o científica, tenen també una importància econòmica, especialment en aquells països en els quals el peix és un aliment habitual.
Així, actualment es treballa amb nombroses espècies de peixos, entre elles el peix zebra, la medaca, la carpa, la truita, el salmó i la palaia. Encara que el nostre coneixement del genoma dels uns i els altres és radicalment diferent, en l'actualitat (novembre de 2005) coneixem més de 10.000 seqüències de gens que s'expressen en 14 espècies de peixos teleósteo. A més, la seqüència completa del genoma dels teleosteos Fgu rubripes , Danio rerio i Tetraodon nigroviridis ja és coneguda.
Microxips: eines per a investigar l'expressió gènica
Tenim peixos i gens que volem estudiar, què fer amb ells? Quina és la metodologia a seguir? Els microbildumas d'ADN o microxips són eines de treball actuals i futures basades en l'anàlisi holística de l'expressió gènica, cada vegada més conegudes. Aquests xips estan formats per centenars o milers de sondes d'ADN corresponents a gens d'interès units en un suport sòlid.
Els microxips tenen només la grandària de les portes de vidre que s'utilitzen en el microscopi i ens permeten detectar simultàniament totes les seqüències que ens interessen i són conegudes. Amb ells es poden detectar molècules addicionals d'ADN i ARN marcades amb diferents marcadors. Per a això, s'extreu l'ARN de cadascun dels òrgans dels peixos (com el fetge) tractats amb contaminants i no tractats, i se sintetitza, mitjançant transcripció inversa, l'ADN auxiliar (cDNA). Aquest cADN constitueix la transcriptoma de la cèl·lula, és a dir, la recopilació de l'expressió gènica del genoma d'aquest animal en aquest moment. Aquest cDNA es pot marcar amb marcadors fluorescents, un en verd i un altre en vermell, en definitiva, amb l'objectiu de diferenciar el material genètic de tots dos organismes. A continuació es combinen les mateixes quantitats de cDNA dels organismes que volem analitzar i comparar i s'hibrida la mescla amb microxip. Així, si en el moment de l'extracció en el peix tractat s'estava expressant molta vitelogenina i en el moment de l'extracció en el qual no es tractava, es podria detectar aquesta diferència pels diferents colors que el xip presentarà per a aquest gen.
En els experiments de laboratori que s'han dut a terme al llarg del món, determinats tipus de peixos s'han mantingut exposats a certs compostos tòxics. En aquests casos s'han desenvolupat microxips sobre algun dels òrgans del peix, per la qual cosa ja es coneix el gen que respon a l'exposició d'aquestes espècies a aquesta mena de contaminants.
Aquests patrons d'expressió no difereixen molt dels coneguts en els mamífers. En l'actualitat, si algun d'aquests organismes que coneixem com canvia el patró d'expressió dels gens es troba sota la influència d'un compost desconegut en el mitjà, tindríem la capacitat d'identificar el tipus de contaminant respecte als patrons d'expressió que coneixem. D'aquesta forma, abans que aquest contaminant pugui causar danys als éssers vius, tindríem l'oportunitat de prendre mesures locals per a evitar-los. De la mateixa manera, una vegada fabricades noves drogues i compostos, podem preveure els canvis que aquests puguin produir als organismes abans de la seva posada en el mercat.
Mecanismes moleculars de contaminants i anàlisis de la qualitat ambiental
En els últims anys els laboratoris que apliquen xips als peixos són cada vegada més nombrosos, tant en experiments de laboratori com en poblacions rurals. En els estudis que s'estan realitzant al Regne Unit, per exemple, s'està tractant de determinar nous biomarcadores moleculars que responguin a contaminants específics i definir quins són els seus mecanismes.
Així, s'han comparat les expressions gèniques dels peixos palaia que habiten en l'àrida ria anomenada Alde i en la contaminada ria de Tyne. Per a això, després de clonar en la palaia gens relacionats amb diferents tipus d'estrès en altres espècies, han dissenyat un microxip de 13.000 seqüències. Després d'hibridar el cDNA dels peixos de totes dues zones amb chipis, s'han trobat diferències expressives significatives en cent seqüències. Els més representatius dels que apareixen induïts en Tyn s'han relacionat amb la presència d'altes concentracions d'hidrocarburs policíclics aromàtics en el mitjà CYP1A1, paraoxonasa, (enzims de la fase I del metabolisme de detoxificación), UDPGT i aldehid deshidrogenasa (enzims de la fase II). Els canvis oposats en la resta de gens, no obstant això, responen a l'estrès global.
A més, han observat que en l'estradiol s'indueixen, entre altres, els gens que codifiquen la vitelogenina i la coriogenina. Alguns d'aquests canvis expressius s'han descrit en altres experiments de laboratori recents. Per exemple, en els mascles de palaia mantinguts durant 21 dies sota l'estradiol d'etinil, més de 200 gens van manifestar diferent expressió en animals tractats. Cal destacar que entre aquests gens es troba induïda l'expressió del gen que codifica la vitelogenina, la UDPGT i la proteïna de la matriu extracelul·lar d'ovòcits, ZTP.
Per tant, els microxips d'ADN són potents eines per a caracteritzar les propietats toxicològiques de les substàncies químiques. Com qualsevol altra tècnica en creixement, encara són necessàries nombroses recerques per a poder definir i considerar l'ús de microxips d'ADN en el camp/ajusto des del punt de vista de l'ecotoxicologia. No obstant això, els microxips són fotografies exactes de l'expressió gènica dels organismes i poden mostrar clarament com la fisiologia del peix es reorganitza sota els efectes dels canvis en el mitjà del peix.
BIBLIOGRAFIA