L'ADN antic, nou camp de recerca

2002/03/01 Andonegi Beristain, Garazi - Elhuyar Zientziaren Komunikazioa Iturria: Elhuyar aldizkaria

• Genetika

En aquesta trobada de dos dies es van donar a conèixer els descobriments de cada grup i es va analitzar el futur de la recerca de l'antic ADN. Entre els participants es trobava la professora i investigadora del campus de Leioa de la UPV, Conchi de la Rúa, amb qui hem pogut mantenir una conversa. Ell ens ha explicat les recerques que s'han dut a terme en un món únic i la seva experiència.

Què és l'ADN antic?

La major part del material genètic d'un organisme s'emmagatzema en el nucli de la cèl·lula com a cromosoma. Els cromosomes estan formats per 3.000 milions de nucleòtids que codifiquen entre 50.000 i 100.000 gens. “No obstant això, la major part de la cadena d'ADN no és un codificador de gens i aquest caràcter neutre fa que l'ADN serveixi per a la recerca genètica”, explica Conchi.

Si comparem l'ADN antic amb l'ADN dels éssers vius, hi ha algunes diferències notables. En primer lloc, la quantitat d'ADN antic que s'obté en les extraccions és molt baixa respecte a la que es pot obtenir d'un viu, entre 0,1 i 1%. I en segon lloc, la cadena d'ADN resultant està fragmentada en cadenes de 100 parells de bases, mentre que en éssers vius es poden obtenir cadenes de milers de parells de bases.

Aquestes diferències es deuen als processos de degradació que es produeixen en les mostres. “Els efectes d'oxidació i hidròlisi que es produeixen després de la mort de l'organisme provoquen la ruptura de la cadena d'ADN, sent de gran importància la conservació de l'organisme per a la qualitat de les mostres en un entorn sec i sense oxigen”, explica. Per aquest motiu, l'edat límit de l'ADN antic se situa en 100.000 anys.

ADN mitocondrial

A causa de l'escàs nombre d'antigues molècules d'ADN recuperades, la majoria dels investigadors s'han dirigit a treballar amb ADN mitocondrial en el cas de l'antic ADN. Com l'ADN nuclear és únic en cada cèl·lula, l'ADN mitocondrial és abundant. Aquesta abundància augmenta la supervivència i les possibilitats de recuperació de l'ADN.

En el cas del mitocondri, la longitud de la cadena d'ADN és de 16.500 parells de bases nitrogenades, la qual cosa suposa el 0,0005% del genoma humà. L'ADN dels mitocondris humans i de diversos vertebrats està seqüenciat i en aquesta seqüència es troba una zona denominada àrea de control. Aquesta zona equivalent en base 1.100 és neutra, de manera que les mutacions només apareixen sota la influència del temps i no per la selecció natural. A més, el punt de control suporta el 90% de les mutacions d'ADN mitocondrial.

A aquestes particularitats cal afegir una altra: L'ADN mitocondrial només es rep de la seva mare. “L'ADN mitocondrial es troba en la cua dels espermatozoides, i durant la fecundació de l'òvul la cua queda fora –diu Conchi–, quedant així fos l'ADN mitocondrial masculí”.

Això suposa reduir a la meitat l'àrea d'estudi i facilitar el seguiment de la marca de deriva genètica.

Iniciació

La primera recerca de l'ADN antic la van realitzar en 1984 amb un animal que va desaparèixer fa 150 anys. Una antiga seqüència d'ADN es va obtenir per primera vegada del teixit muscular sec d'un equus quagga. D'aquesta seqüència, van demostrar la relació evolutiva entre el quagga i els parents més pròxims d'avui, la zebra.

Un any després, en 1985, altres investigadors van recuperar l'ADN de les cèl·lules superficials de les mòmies. De les 110 mòmies seleccionades, 23 estaven més ben conservades i només dues d'elles van obtenir ADN. Aquest pas va ser l'inici de l'estudi de l'antic ADN humà.

Continuant amb les recerques, a mitjan dècada dels 90 es va aconseguir seqüenciar fragments d'ADN de vertebrats ja desapareguts, com el Thylacinus o el llop martsupial (120 anys), el Smilodón o tigre ‘amb dents de sabre’ (14.000 anys), el mamut fosc (10.000-50.000 anys) i el model (3.300 anys).

A més, es va estudiar una fulla de magnolia anomenada Dt. (17 milions d'anys) i diversos insectes emmagatzemats en l'ambre, però els seus estudis no es consideren actualment fiables. “No s'ha aconseguit repetir els resultats obtinguts en aquests laboratoris ni en el mateix ni en uns altres, la qual cosa invalida els resultats”, afirma Conchi. “No obstant això, va quedar demostrat que l'ADN antic era recuperable”.

En 1986 es fa un pas més important en llançar el nou mètode d'anàlisi PCR. Aquesta tècnica va revolucionar la recerca de l'ADN i va permetre el descobriment dels gens mitocondrials.

Mètode PCR

La reacció en cadena o mètode PCR de la polimerasa consisteix a sintetitzar milions de còpies d'un petit fragment d'ADN. En aquest procés cíclic

Part de la cadena d'ADN es duplica exponencialment fins a disposar de mostres suficients per a aplicar els diferents mètodes d'anàlisis. El PCR requereix el disseny de cadenes d'ADN curtes amb funció limitant, complementàries de la cadena d'ADN objecte d'estudi. La funció d'aquests limitadors és fixar la longitud de la cadena d'ADN a duplicar, ja que s'afegeixen al principi i al final. A continuació, l'enzim denominat Taq polimerasa realitza el doblatge de la cadena d'ADN.

Així, el mètode PCR va permetre ampliar els estudis a ossos i dents i, a l'ésser un material corrent procedent d'excavacions arqueològiques, es va obrir la porta a l'estudi de la història biològica dels segles.

Problemes metodològics i contaminació

No obstant això, la capacitat de duplicació del mètode PCR es converteix en un problema en el cas de l'antic ADN. L'ADN antic té un alt risc de contagi en entrar en contacte amb qualsevol element extern. Tenint en compte això, i atès que les antigues cadenes d'ADN que es recuperen són curtes, el mètode de PCR té una gran probabilitat de copiar fragments d'ADN externs. Per això, és imprescindible adoptar una sèrie de mesures per a assegurar el resultat del doblatge.

En primer lloc, s'ha d'assegurar l'aïllament físic del laboratori perquè no afecti elements externs; en segon lloc, s'ha d'utilitzar únicament l'equipament destinat a la recuperació de l'ADN antic i, finalment, s'ha d'assegurar la total esterilitat de les mostres a utilitzar. Aquestes mostres se solen extreure dels grans que millor es conserven, generalment usant ossos i dents. “La quantitat d'ADN antic disponible extret de la polpa és major que la que s'obté de la resta de teixits o ossos, i a més en els jaciments sol ser una peça comuna”.

A més de totes les mesures esmentades, els estudis han de repetir-se tant en el mateix laboratori com en diferents laboratoris, utilitzant més d'una mostra del mateix exemplar, la qual cosa assegura l'existència o no de contaminació. Finalment, per a homologar l'antiga seqüència d'ADN, s'ha de comparar amb l'univers de seqüències conegudes que s'emmagatzemen en les bases de dades, analitzant posteriorment els resultats en un context filogenètic adequat i comparant-los amb les seqüències d'altres espècies vives o mortes d'un mateix grup taxonòmic.

Quins mètodes utilitzeu per als exàmens?

“Es poden utilitzar dos mètodes, un de seqüenciació i un altre d'anàlisi d'enzims restrictius”.

La seqüenciació és conèixer la localització de les bases nitrogenades responsables de la informació genètica en la cadena d'ADN. Aquest mètode automàtic amb diversos passos consisteix en una amplificació especial de la cadena d'ADN, on s'obtenen fragments fluorescents de diferents grandàries. A continuació es distribueixen mitjançant electroforesi, és a dir, se separen entre si en un gel sobre el qual s'aplica un camp elèctric. La velocitat de migració depèn de la grandària. En aquest procés un lector làser detecta l'emissió fluorescent de cada part, que depèn de l'última base nitrogenada que es va afegir en el procés de PCR. En conseqüència, es coneix la base nitrogenada en funció de la fluorescència que es desprengui.

Amb els enzims restrictius s'analitzen les seqüències de destinacions. “Les seqüències de meta són cadenes curtes de parell nitrogenat en la cadena ADN”. Els enzims restrictius són capaços de trencar la cadena d'ADN des d'on es troben les seqüències de destinació. Aquestes seqüències de meta, que tenen una longitud de 4-6 parells de bases nitrogenades (pb), són diferents per a cada enzim reductor, és a dir, un enzim reductor ha de trobar una seqüència de metes per a poder trencar la cadena d'ADN, que en moltes ocasions no existeix. “Veient si la cadena ADN reacciona o no amb diferents enzims, podem saber si té diferents seqüències de destinació i si es tracta o no de seqüències de destinació, segons els diferents patrons existents, podem veure genètics relacionals”. Metodològicament aquesta segona tècnica és més senzilla i ràpida, la qual cosa permet obtenir més resultats positius.

Futur pròxim

En els últims anys la recerca de l'ADN antic s'ha centrat en la cerca de relacions filogenètiques, en l'estudi de la variabilitat genètica al llarg del temps o en la recerca de canvis demogràfics. Tot això es deu als avanços en biologia molecular i al desenvolupament de la tècnica PCR. No obstant això, encara queden obstacles com el risc de contaminació i la mala conservació de l'ADN antic.

De cara al futur, l'estudi està orientat a millorar la metodologia d'extracció de l'ADN i a augmentar el nombre de mostres antigues. A més, les noves recerques se centraran en aprofundir en la recerca de l'ADN nuclear. Aquests indicadors permetran no sols analitzar la informació rebuda de la seva mare, sinó també la del seu pare. El futur ens donarà el límit d'aquesta ciència?

I Espanya de l'ADN antic. Congrés En la Residència de la Vidriera de la Universitat Autònoma de Madrid, situada en Miraflores de la Serra, s'ha celebrat la I Edició Espanyola de l'ADN antic. Congrés. Entre els convidats es trobaven experts de 15 centres de recerca dedicats a la biologia evolutiva, paleobiología, antropologia, genètica molecular, forense i ictología. Aquests grups d'investigadors es van plantejar conèixer i aprofundir en els objectius comuns de la seva ciència. Entre aquests objectius es va analitzar la creació d'un grup de treball sobre l'ADN antic. Aquest grup s'encarregaria d'establir un procediment bàsic per a garantir la qualitat de les recerques en aquesta ciència. Un altre dels objectius era reforçar les relacions entre laboratoris, impulsant la col·laboració entre els grups investigadors. Finalment, es va comentar la intenció de donar a conèixer les potencials aplicacions d'aquest camp científic perquè la gent tingui en compte les possibles aplicacions de la recerca de l'ADN antic en altres camps.

Què hi ha a Euskal Herria?

Conchi de la Rúa i el seu equip dirigeixen les seves recerques a l'antropologia. El mètode dels enzims restrictius ha permès classificar el 97% de les mostres lliures de contaminació de diversos jaciments bascos. Encara que el percentatge sembla alt, cal dir que tan sols el 25% de les mostres recuperades estan representades, ja que només s'han analitzat les dents en perfecte estat per a evitar el risc de contaminació.

Entre els descobriments s'han obtingut dades per a oposar-se a les teories d'alguns investigadors italians. Aquests investigadors italians informaven sobre un grup que fa entre 10.000 i 15.000 anys es va estendre des del País Basc a Europa. L'objectiu d'aquesta teoria era explicar l'abundància d'un grup genètic existent actualment en la societat basca, el denominat V Haplotalde. Els treballs dels investigadors bascos han demostrat que existeix l'absència d'aquest grup en les mostres d'ADN antigues, és a dir, que no hi ha indicis d'aquesta època de l'haplotalde. Què significa això? “Que aquest grup d'Haplots no es va crear aquí perquè si fora d'aquí hauria d'aparèixer en mostres amb menys de 10.000 anys d'antiguitat”.

Conchi i els seus companys posen el punt de vista en la deriva genètica per a explicar l'abundància d'aquest grup. “La mutació que defineix l'Haplotaldea va poder aconseguir una taxa elevada en un grup de població, com és el cas de Guipúscoa, en una època en la qual la població era reduïda, i els creixements de població posteriors van permetre ampliar aquesta mutació”.