Visibility invisible: microscopie d'expansion

2022/08/31 Jon Ander Nieto Garai - Biokimika eta Biologia Molekularreko doktoratu osteko ikertzaileaEHU | June Olazar Intxausti - Biokimika eta Biologia Molekularreko doktoradutza aurreko ikertzaileaEHU Iturria: Elhuyar aldizkaria

Comment pouvez-vous observer les structures nanoscopiques sans dépenser un million d'euros ? Les découvertes de microscopie de pointe ont toujours été à la portée de quelques scientifiques millionnaires du moment. Afin de contrecarrer cela, il est arrivé à un groupe d'individus qui, si nous ne pouvons pas considérer le microscope structures nanoscopiques, pourquoi ne pas augmenter sa taille? C'est ce que nous connaissons aujourd'hui sous le nom d'espion-microscopie.

Fonctionnement du microscope spatial. Ed. June Olazar Intxausti et Jon Ander Nieto Garai

XIX. Comme dans le XXe siècle avec la physique, les découvertes biologiques qui peuvent être faites dans le monde macroscopique sont rares aujourd'hui. Les jours où la paléontologue testée Mary Anning, avec son marteau à la main et guidée par une simple motivation, trouvait des dizaines d'espèces disparues sur les plages anglaises, ont pris fin. Aujourd'hui, pour comprendre les processus biologiques qui régissent nos vies et réaliser des progrès significatifs dans le domaine de la biologie et de la médecine, nous devons analyser des organismes, des structures, des molécules et des processus que nous ne pouvons voir à l'œil nu.

L'homme peut distinguer des objets de taille 0,1 mm. Toute taille est considérée comme microscopique et n'est pas visible à l'œil nu. Pour cela, nous avons besoin d'instruments qui nous aident à améliorer l'image de ce que nous voulons observer, les microscopes.

Microscope optique XVII. Il a commencé à être utilisé en Europe au XXe siècle, ce qui a permis de surmonter la barrière macroscopique et de pénétrer dans le monde microscopique. Les premiers microscopes optiques ont permis de localiser des protozoaires, des bactéries et d'autres micro-organismes inconnus, en modifiant complètement le paradigme de l'époque. Mais comme pour de nombreuses découvertes scientifiques, le microscope optique a apporté plus de questions que des réponses, car dans le monde microscopique beaucoup d'organismes n'ont pas de couleur, sont transparents, ils ont donc dû concevoir des méthodes de teinture pour pouvoir les observer.

De même, même si ces teintures permettaient de séparer un tissu, une cellule ou un organnule d'un autre, elles n'apportaient pas beaucoup d'informations quant au niveau moléculaire. Ainsi, comme l'avancement des encres initiales, XX. dans la deuxième décennie du XXe siècle a été développé la première fluorescence -microscope. Ce type de microscope utilise la lumière émise par les molécules fluorescentes pour observer les détails de l'échantillon.

Figure . Fluorescence - fonctionnement du microscope. Ed. June Olazar Intxausti et Jon Ander Nieto Garai

Un microscope à fluorescence de pointe peut séparer deux molécules ou structures à une distance égale ou supérieure à 250 nm, avec une résolution 400 fois supérieure à celle de l'œil humain. Ceci est appelé limite de résolution et est l'une des caractéristiques les plus importantes d'un microscope.

Cette limite de 250 nm n'est pas suffisante pour séparer des molécules individuelles, c'est pourquoi, dans les années 90, une microscopie à super-résolution a été développée, dont la résolution atteint 25 nm [1]. Récemment, la technique de superrésolution MINFLUX a permis de réduire cette limite à 3 nm [2]. Cette technique permet de distinguer des structures à une distance de 3 nm, c'est-à-dire des structures 25 000 fois plus petites qu'un poil humain, en tant que molécules uniques.

Comme on peut le voir, dans l'histoire de la microscopie chaque fois qu'une barrière se brise, une autre apparaît. Dans de nombreux cas, ces barrières ont été techniques (comment obtenir une meilleure résolution? ). ), mais, par exemple, si l'on atteint la limite de résolution d'une seule molécule avec la technique MINFLUX, la barrière qui a été trouvée est une autre: la barrière économique. Malheureusement, en augmentant la résolution augmente également le coût des microscopes de superrésolution. En général, ils nécessitent des infrastructures très coûteuses et des logiciels sophistiqués qui ne sont accessibles qu'à quelques laboratoires. Par exemple, un nouveau microscope MINFLUX coûte 2 millions d'euros.

La plupart des laboratoires ne peuvent donc pas dépasser cette dernière barrière et doivent se contenter de microscopes conventionnels à fluorescence. Cependant, en 2015, une équipe de recherche a trouvé le moyen d'étendre la nanoscopie à ces laboratoires, abordant le problème d'un autre point de vue: si mon microscope n'a pas assez de capacité pour différencier la structure que je veux voir, pourquoi ne pas l'augmenter? L’expurgo-microscopie est ainsi née [3].

Microscopie d'expansion

La prémisse de la microscopie spatiale semble conceptuellement assez simple. Mais il est techniquement complexe. Dans une technique microscopique traditionnelle, l'échantillon est marqué avec des molécules fluorescentes pour observer les structures d'intérêt, mais dans le reste l'échantillon est maintenu, de sorte qu'il conserve sa forme et sa taille originale. Dans la microscopie d'espantsé, pour séparer de très petites structures, l'échantillon est étalé sur trois dimensions jusqu'à atteindre la taille suffisante pour être observé avec un microscope à fluorescence conventionnel [4].

Mais comment se propage un échantillon biologique, une cellule, jusqu'à devenir 10 fois plus grand que la taille originale? Le secret est dans les couches. Les couches ont un gel qui absorbe le liquide en contact avec l'eau (ou l'urine), l'hydratant et l'étendant pour éviter l'humidité. La microscopie d'expansion consiste à utiliser un composé similaire qui s'hydrate en contact avec l'eau et se propage en trois dimensions. En particulier, cette technique novatrice utilise la composite N,N-diméthylacrylamide (DMAA) qui polymérise avec l'acrylate de sodium (SH) pour former une matrice ou un gel en trois dimensions. Ce gel est déposé dans de l'eau distillée en capturant des molécules d'eau à l'intérieur et a la capacité de s'étendre en trois dimensions jusqu'à 10 périodes. Cette propriété viserait à étendre les structures biologiques avec le gel de DMAA [5].

La première chose à faire est de fixer notre échantillon biologique. Le processus de fixation immobilise la cellule, la gardant à un moment donné et arrêtant les réactions chimiques de la cellule. Ainsi, la cellule se gèle dans le temps et ne se dégrade pas dans les étapes suivantes.

Une fois fixée, l'échantillon doit être marqué fluorescent, car comme on l'a dit, la plupart des structures biologiques sont incolores. L'une des méthodes les plus utilisées pour l'obtention est celle basée sur les anticorps. Les anticorps sont des protéines qui sont spécifiquement connues et reliées à d'autres molécules ou structures. Si ces anticorps sont attachés à un conjugué fluorescent, ils peuvent être utilisés pour localiser et détecter la molécule que nous voulons étudier.

Une fois l'échantillon marqué par fluorescence, il sera ancré dans la salle DMAA. Ce processus d'ancrage est indispensable et constitue l'une des étapes les plus importantes de la microscopie d'espantarctique, qui assure la propagation de l'échantillon biologique avec la salle. Dans cet ancrage, les molécules fluorescentes qui marquent la position des structures d'intérêt sont reliées au polymère DMAA par une liaison covalente. Les fluoroforums sont ainsi reliés à la salle de classe et maintiennent une position relative avec les autres fluoroforums.

Une fois le processus d'ancrage terminé, le gel DMAA et les molécules fluorescentes de notre échantillon deviennent une seule entité, qui se développe entre eux et entre eux. Enfin, le moment est venu d'élargir notre échantillon. Cependant, il faudra faire face à un dernier problème, car les cellules possèdent des structures rigides appelées cytosquelettes et matrice extracellulaire, qui forment un échafaudage pour maintenir la forme de la cellule et du tissu et aider à combattre les déformations mécaniques. Si vous essayez de les diffuser à partir de ce point, les forces de cohésion provoquées par ces structures s'opposeront aux forces d'expansion du gel, brisant et déformant notre échantillon. Pour éviter cela, digérer l'échantillon. Dans ce processus digestif, l'échantillon est traité avec une enzyme appelée Protéinase K, qui coupe et dissipe toutes les protéines qui composent le cytosquelette et la matrice extracellulaire, et permet la destruction et l'expansion de l'échafaudage qui maintient la taille cellulaire.

Maintenant que nous avons défait le cytosquelette et la matrice extracellulaire, nous pouvons hydrater et étendre notre chambre. Dans ce processus, la molécule d'eau absorbe les gels de DMAA et s'accumulent à l'intérieur, gonflant la pièce comme un ballon. Comme le gel de DMAA est constitué d'une matrice symétrique tridimensionnelle, l'expansion se produit également en trois dimensions et notre échantillon biologique est ancré dans la pièce et se propage avec elle. Ainsi, une cellule de 30 microns, pour nous invisible, peut s'étendre jusqu'à 10 fois dans toutes ses dimensions, jusqu'à 300 microns (0,3 mm). Des molécules qui étaient auparavant à une distance de 25 nm et qui ne pouvaient être séparées que par un microscope à superrésolution, sont maintenant à une distance de 250 nm et peuvent être examinées en fluorescence conventionnelle avec un microscope. La microscopie d'écriture spatiale facilite donc l'accès au monde nanoscopique à ceux qui ne peuvent pas y investir des milliards.

Figure . Fonctionnement du microscope spatial. Ed. June Olazar Intxausti et Jon Ander Nieto Garai

La microscopie d'expansion fournit donc un accès direct aux découvertes de ceux qui n'ont pas accès à des logiciels ou des appareils sophistiqués, de sorte que cette possibilité ne reste pas entre les mains de quelques-uns. On peut dire qu'il permet d'aller au-delà de la situation économique des groupes scientifiques et que l'accès à l'information dépend des compétences scientifiques, comme à d'autres époques, et non de l'argent. Ainsi, n'importe quel sujet — comme Mary Anning l'a été à l'époque — serait capable de réaliser des découvertes aussi importantes que le squelette de l'ichtyosauro, avec quelques matériaux disponibles.

BIBLIOGRAPHIE

[1] Nieto Garai JA., Lorizate M. et Contreras FX. 2021 “Shedding light on membrane rafts structure and dynamics in living cells. Biochimica et biophysica acta. Biomembranes, 1864, 183813.

[2] Balzarotti F., Eilers Y. C. Gwosch, Gynna A. Westphal V. Stefani F. Elf J. et Hell S. 2017 “Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”. Science 355, 606-612.

[3] Chen F., P. Tillberg W. et Boyden E. S. 2015. “Extension microscopy”. Science 347, 543–548.

[4] Faulkner E. Thomas S. et Neely R. 2020. “An introduction to the methodology of expansion microscopy”. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 124, 105764.

[5] Truckenbrodt S., Maidorn M., D. Crzan, Wildhagen H. Kabatas S. et Rizzoli S. 2018. “X10 expansion microscopy enable 25-nm resolution on conventional microscopes”. Recueil EMBO, 19, e45836.